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        惠利健教授:肝臟細胞的獲取及其在3D生物打印中的應用
        2016-08-27  來源:捷諾飛  作者:捷諾飛

        引言

        在第一屆Regenovo生物3D打印學術論壇上,來自中科院上海生命科學研究院的惠利健教授分享了一些在3D生物打印中肝臟細胞獲取方面的研究工作成果。


         


        三維打印不可或缺的三樣東西,一個材料,一個生物細胞,還有一個是打印的設備。我的研究方向是功能肝細胞的獲得,今天我想給大家講講過去怎么獲得細胞和細胞在3D打印上的一些可能的應用,以及如何從基礎走到一些應用方面的。


        原代肝細胞間互相會形成非常緊密的連接,這是上皮細胞的一種特點。肝細胞有很多用途,比如說藥物篩選、人的疾病模型,還有20年前大家開始用肝細胞移植來治療代謝性肝病等等一些中末期疾病。 


        肝臟細胞的來源與獲得


        細胞來源的獲得是一個大問題,這個問題的存在也由來已久。從干細胞生物學的角度來看,存在以下幾種可能性:其中一種就是ES細胞(Embryonic stem cell)即胚胎干細胞分化,ES細胞它具有全能性,可以分化成身體的所有功能組織細胞。另一種是可誘導多能干細胞(iPS,Inducedpluripotent stem cell)分化。這兩種細胞在功能上以及很多方面都非常類似,可以在體外進一步定向分化成肝臟細胞。但是這兩種方法都很困難,費時費力,成本也很高。


        我們使用的是一種可以成纖維細胞直接變成肝細胞(hiHep)的轉分化方法。有了這個hiHep細胞之后,可以對它的功能進行一系列的分析比如肝臟分泌的白蛋白、AAT等,還可以分析其脂代謝、糖原代謝以及一些解毒功能。此外,實驗證明了這些hiHep細胞移植到體內之后能夠部分地治療患有肝臟代謝性疾病的小鼠。


        形態對比


        既然現在可以有轉分化hiHep,它和由ES和iPS在定向分化成的肝細胞來比有什么不同?為此我們做了一系列的比較,發現它們在形態上其實非常接近,從白蛋白和AAT這兩個肝臟特定的分泌蛋白的染色來看,百分之八九十的細胞都是雙陽性的,證明這些最后重編程獲得的肝細胞純度非常高。從一些功能相關的基因表達上面來看,也和原代肝細胞也非常接近。


        功能檢測


        肝臟最重要的功能就是代謝,肝臟代謝主要就是膽汁排泄功能和CYP酶的氧化功能。從三種不同的與膽汁排泄相關的藥物進行的實驗來看,在hiHep、iPS分化獲得的肝細胞和原代肝細胞這三種細胞中呈現的結果整體上是非常接近的。


        從另外一個CYP3A功能的項目中,可以看到iPS分化得到的肝細胞和hiHep都有很好的代謝功能,當然,原代肝細胞代謝功能更好。


        AFP是胚胎肝里面表達的甲胎蛋白,只有在胚胎時期的肝臟才分泌。iPS來源的肝細胞甲胎蛋白表達特別高,就證明這個細胞其實成熟度不是特別高。用AFP染色去分析,可以看到iPS來源的肝細胞這些標志物表達量都很高,而hiHep細胞的表達量很低,原代肝細胞也不表達。相比之下,說明hiHep細胞相對于iPS來源的肝細胞更成熟一點,在體內的效果可能更好。這些工作證明,看起來都非常接近的兩個細胞,實際上還有很多不一樣的。


        臨床再生醫學的應用和體外的三維培養


        這些細胞要應用在臨床的移植,就會面臨很多技術挑戰。幸運的是,早前就已經有設計好的體外人工肝支撐系統,可以在體外幫助肝衰竭的病人獲得一些功能性的支撐。血漿經過生物人工肝中的肝細胞解毒代謝或者獲得營養成分以后再流回體內。這樣的技術支持,可以讓我們培養的肝細胞避免進入體內,從而解決了排斥或者致瘤性這樣的問題。


        (1)小鼠實驗:

        小鼠實驗用到了刀豆蛋白誘導的急性肝衰竭模型。實驗結果顯示成纖維細胞和HepG2細胞都沒有治療效果,而用hiHep細胞和原代肝細胞的組,小鼠有30%~40%的成活率。


        (2)大動物實驗:

        大動物實驗我們選擇了肝衰竭的豬模型。肝衰竭豬的在體外流經生物人工肝裝置的反應器,最后又回到豬的體內。急性肝衰竭的豬如果不接受治療的話會快就會死亡,而經過生物人工肝的裝置治療后,有接近80%的動物都活了下來。


        對此我們也做了一系列詳細的分析,包括血氨等一些血生化指標檢測。更重要的是治療后的肝臟里面有很多平時看不見的增殖細胞,證明了在生物人工肝治療之后,誘導了肝臟再生。


        現在我們也開始在患者中開展安全性臨床研究。


        (3)體外實驗:

        在體外用肝細胞能夠構建微器官,這要考慮到功能和結構形態。結構形態是保證功能非常重要的一點。器官中最核心的一點是血管。血管的供血和養分供應一旦出問題,器官或者微器官就會出問題。


        為了構建微器官,我們首先把hiHep細胞形成一個單細胞的組織。我們將hiHep細胞放在一個特殊的培養皿中,細胞會自己聚團并在上面形成一個微球,這些細胞可以增長,大概長到差不多維持在200到300微米這個大小的時候就會停止。其次,我們需要先把血管內皮細胞和hiHep肝細胞進行共培養。我們發現HUVEC和hiHep細胞可以很好地在一起。


        下一步可能會開始考慮形成膽管這樣的結構。從長遠角度來說,如果形成這么一種有膽管和血管的一個肝臟微器官,我們可以用它們來研究再生、纖維化等等。如果這些肝臟微器官最后證明是安全的話,那么可以用這些微器官在肝臟患者中進行移植。


        第一屆Regenovo生物3D打印學術論壇由浙江省醫學信息與生物三維打印重點實驗室主辦;杭州捷諾飛生物科技有限公司承辦;火石創造媒體支持

         

         

         

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